Köhler-verlichting en fasecontrast: wanneer het ertoe doet

Leestijd: ± 6 minuten

Twee woorden uit de specificatielijst die de prijs van een doorlichtmicroscoop verdubbelen en die de meeste kopers overslaan: Köhler en fasecontrast. Het ene gaat over het licht dat u op het preparaat zet, het andere over het zichtbaar maken van cellen die geen kleur hebben. Voor de biologieles is geen van beide nodig; voor wie fotografeert, meet of levende cellen bekijkt, zijn ze het verschil tussen een microscoop en een goede microscoop.

Eerst de condensor, dan pas de lamp

Onder de tafel van elke doorlichtmicroscoop zit een condensor: een lens die het licht van de lamp bundelt en in het preparaat stuurt. De eenvoudigste, op de OBS 102 en OBT 101, is een vaste lens met NA 0,65 — genoeg voor 400x, te weinig voor het 100x-olie-objectief. De Abbe-condensor met NA 1,25 en een aperturediafragma, standaard vanaf de OBS 113 en op alle OBE en OBL, is de werkelijke minimumeis: met het diafragma regelt u contrast en scherptediepte, en bij 1000x levert hij het licht dat het olie-objectief nodig heeft.

De vuistregel die in geen enkele handleiding staat: zet het aperturediafragma op ongeveer twee derde tot drie kwart van de NA van het objectief. Helemaal open geeft een plat, contrastarm beeld; te ver dicht geeft contrast maar ook diffractieranden rond elk detail. Wie de condensor nooit aanraakt, kijkt jarenlang naar een slechter beeld dan de microscoop kan geven.

Wat Köhler-verlichting doet

August Köhler loste in 1893 een hinderlijk probleem op: bij gewone verlichting zag u de gloeidraad van de lamp in het beeld, en het veld was in het midden lichter dan aan de rand. Zijn opstelling voegt een tweede diafragma toe — het veldiafragma, bij de lamp — en zet de lenzen zo dat de lamp zélf nergens scherp wordt afgebeeld, terwijl het preparaat gelijkmatig wordt belicht over precies het gezichtsveld, niet meer. Minder strooilicht, meer contrast, een egaal veld.

Voor het oog is het verschil subtiel; op een foto en in een meting is het groot. Een camera registreert elk helderheidsverloop, en software die cellen telt of een oppervlak meet, telt donkere hoeken mee als object. Daarom is Köhler de norm zodra een trinoculaire kop met camera in beeld komt. Bij de KERN OBL is de condensor af fabriek gecentreerd en de Köhler-instelling vast — u hoeft niets te doen, en kúnt ook niets verkeerd doen. Bij de OBN is de condensor centreerbaar en stelt u Köhler zelf in: meer werk, maar ook te corrigeren na een objectiefwissel of als de laborant het anders wil. Voor een routinelab is de OBL daarom de prettigere keuze, voor onderzoek de OBN.

Fasecontrast: cellen zien zonder ze te kleuren

Een levende cel is doorzichtig. Het licht gaat erdoorheen zonder veel donkerder te worden; het wordt alleen een fractie vertraagd — in fase verschoven — door de kern, de membranen, de organellen. Het oog ziet faseverschillen niet. Fasecontrast (Frits Zernike, Nobelprijs 1953) zet die verschuiving om in helderheid met een ring in de condensor en een bijpassende ring in het objectief: structuren die in helderveld onzichtbaar zijn, worden donker tegen een lichte achtergrond, zonder kleuring en dus zonder de cel te doden.

Wie het nodig heeft: iedereen die naar levende cellen kijkt. Celkweek, sperma-analyse, bacteriën in vloeistof, gist in de brouwerij, protozoa in oppervlaktewater, bloedplaatjes. Wie het niet nodig heeft: iedereen met gekleurde preparaten — histologie, de biologieles, gramkleuring. Voor gekleurd weefsel maakt fasecontrast het beeld zelfs slechter; daarom hebben fasecontrastmicroscopen altijd ook een helderveldstand.

De techniek vraagt per vergroting een eigen objectief (PH-plan) en een bijpassende ringschuif of condensorstand. KERN levert dat op drie manieren. Als complete microscoop: de OBL 146 (binoculair, 1.580 euro) en OBL 156 (trinoculair, 1.700 euro) met fasecontrastcondensor en PH-objectieven, en de OBN 158 en 159 (2.920 en 2.940 euro) met een universele draaicondensor voor 10x, 20x, 40x en 100x. Als set voor een bestaande infinity-microscoop: PH-condensor plus schuif plus PH-objectief per vergroting, 340 tot 570 euro voor de OBL, 285 euro per stand voor de OBN. Of als de grote oplossing voor de OBN: de condensorwiel-set met vier PH-objectieven (OBB-A1237, 1.790 euro). Voor de school- en OBE-modellen bestaat het niet — hun condensor en objectieven zijn er niet op gebouwd.

De goedkopere buren: donkerveld en polarisatie

Twee technieken halen een deel van hetzelfde effect voor een fractie van de prijs. Donkerveld blokkeert het directe licht met een centrale stop in de condensor, zodat alleen het licht dat het preparaat verstrooit het objectief bereikt: alles licht op tegen een zwarte achtergrond. Spirochetén, diatomeeën, vlokken in water, stofdeeltjes — spectaculair, en de donkerveldset voor objectieven tot 40x kost 95 euro (OBB-A1148). Boven de 40x hebt u een olie-donkerveldcondensor nodig (250–290 euro). Polarisatie — een polarisator onder en een analysator boven het preparaat, 150 tot 290 euro als eenheid — laat dubbelbrekende structuren oplichten: zetmeelkorrels, kristallen, vezels, uraatkristallen in gewrichtsvocht. Geen vervanging voor fasecontrast bij cellen, wel het juiste gereedschap voor die materialen; wie er dagelijks mee werkt, kijkt naar de OPO polarisatiemicroscoop met draaitafel.

Veelgestelde vragen over verlichting en contrast

Heb ik Köhler nodig voor de biologieles?

Nee. Voor gekleurde preparaten bij 100x tot 400x volstaat een Abbe-condensor met diafragma. Köhler wordt belangrijk bij fotografie, metingen en 1000x met olie.

Kan ik fasecontrast toevoegen aan mijn OBE?

Nee; de OBE heeft eindige optiek en een condensor zonder ringhouder. Fasecontrast is er voor de infinity-series OBL en OBN en voor de omgekeerde OCM. Overweegt u fasecontrast op termijn, kies dan nu een OBL.

Wat is het verschil tussen fasecontrast en DIC?

DIC (differentieel interferentiecontrast, "Nomarski") geeft een reliëfbeeld zonder de lichte halo van fasecontrast, maar vraagt speciale prisma's en spanningsvrije objectieven en kost een veelvoud. In het KERN-programma is fasecontrast de praktische keuze voor levende cellen.

Waarom zie ik een lichte rand om elke cel bij fasecontrast?

Dat is de halo, eigen aan de techniek: aan sterke faseovergangen ontstaat een lichte zoom. Hij wordt groter als de condensorring niet precies op de objectiefring staat; centreer de ring met het centreeroculair (OBB-A1544) en de halo wordt minimaal.

Is LED goed genoeg voor fasecontrast en 1000x?

Ja. De 3 W-LED van de OBL en OBN geeft ruim voldoende licht, is dimbaar en wordt niet warm. Halogeen heeft alleen nog een plaats waar een continu spectrum telt, en HBO of LED-eenheden voor fluorescentie.